NY∕T 3234-2018 牛支原体PCR检测方法(农业)
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ID： |
2C248FD5FB0646C2ABA900C47236A500 |
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文件大小(MB)： |
0.35 |
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页数： |
9 |
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文件格式： |
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日期： |
2021-12-23 |
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ICS 11.220,B 41 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/T 3234一2018,牛支原体PCR检测方法,PCR method for detection of Mycoplasma bovis,2018 一05-07 发布2018-09-01 实施,中华人民共和国农业农村部发布,目U 吕,本标准按照GB/ T 1. 1-2009 给出的规则起草,本标准由农业农村部兽医局提出,本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SACj TC 181) 归口,NY/T 3234-2018,本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、华中农业大学、中国动物卫生与流行病学,中心,本标准起草人:辛九庆、李援、郭爱珍、宋建德、王岩,I,NY/T 3234-2018,引,牛支原体(Mycoρ lasma bovis ,M bovis) 在分类上属于支原体目支原体科支原体属成员。虽然该病,原于1961 年首次在美国患有乳房炎的病牛中分离到，但一直被认为是小反鱼动物支原体一一元乳支原,体(Mycoρ lasma agα lactiae ,M agalactiae) 的一个亚种，直到1976 年才被命名为牛支原体,牛支原体是一种多形性的微生物，外观呈球形、星状、丝状，大小为(1 25 ~ 150)μmX (0. 2~,O. 8) 间，缺少细胞壁。能通过450 nm 滤膜，压挤下能通过220 nm 滤膜，与原生质体相似，但对渗透性,溶胞作用有较强的抵抗力，并且在原生质体溶解的条件下还能存活。其基因组大小约为1 Mbp ,G+C,含量为29.76% ,牛支原体已经在北美洲和欧洲等地广泛流行，并造成了严重的经济损失。主要引起牛的肺炎、关节,炎、乳房炎、中耳炎等，有时也会引起角膜结膜炎、子宫内膜炎、输卵管炎、卵巢炎、流产和精囊炎。这些,常见的疾病被统称为牛支原体相关疾病(Mycoρ lasma bovis - associated disease ， MbAD) 。该病原已经,随着动物贸易的发展扩散到世界各地,2008 年，我国首次从患有肺炎的棋牛肺脏中分离到牛支原体，目前已经广泛流行于全国各地，威胁,着我国的养牛业，并造成了巨大的经济损失。由于其临床表现和病理剖检变化与牛传染性胸膜肺炎(牛,肺疫)相似，必须进行实验室诊断才能最终确诊,E,牛支原体PCR 检测方法,范围,本标准规定了牛支原体PCR 检测方法的技术要求,本标准适用于实验室对牛肺组织、菌液培养物的检测,2 规范性引用文件,下列文件对于本文件的,件。凡是不注日期的引用文件,GB 19489 实验室生,3 仪器与试剂,3. 1 仪器,3. 1. 1 台式高速离,3. 1 . 2 1. 5mL 离,3. 1. 3 生,3. 1. 4 PCR 扩增,3. 1.5,3. 1. 6 20C~80C,3. 1.7 电泳仪、电,3. 1. 8 可调微量,3.2 试剂,3. 2. 1 电泳缓冲液(,3. 2. 2 DNA 分子,3. 2. 3 除特殊说明外,3. 3 引物及引物配制,上游引物: 5' - TTTT,下游引物: 5' - GGCTCTCA,引物用灭菌去离子水稀释至10,3. 4 牛支原体阳性样晶及阴性样晶的制,NY / T 3234-2018,以灭活前浓度为108 CCU/ mL 的牛支原体菌液站歹H#j，田指定单位提供) ，经PCR 检测元乳支原,体、丝状支原体和精氨酸支原体均为阴性后作为标准阳性样品;以健康牛肺脏样品CPCR 检测牛支原体,阴性)为标准阴性样品;以灭菌ddH2 0 作为空白样品,4 样晶采集与处理,4. 1 样晶采集,选取有明显病变和健康交界处组织，无菌采集病牛肺脏，剪成3 cm~5 cm 方块送实验室备用,1,NY/T 3234-2018,4. 2 样晶处理,取0.5 g 待检样品(肺脏)于已洗净、灭菌并烘干的匀浆器中充分研磨，加10 mL 灭菌生理盐水混,匀，反复冻融3 次， 3000 r/ min 离心15 min 。取上清液转入元菌的1. 5 mL Eppendorf 管中，编号备用,PCR 试验中阳性对照样品使用3.4 中的牛支原体菌液培养物,样本在20C~80C条件下保存应不超过24 h。若需长期保存，应放在一70 0C 冰箱或液氮中，但应避,免反复冻融,5 操作方法,5. 1 基因组DNA 的提取,在样本制备区进行，有关生物安全和防止交叉污染的措施见附录B ,使用市售的DNA 提取试剂盒提取组织、培养物种的DNA ， 具体操作参照试剂盒说明,5.2 PCR 反应所用引物,使用3. 3 中配制好的引物溶液,5. 3 PCR 反应体系及反应条件,配置PCR 反应体系在反应混合物配制区进行;加样在样本处理区进行,PCR 体系如下所示:,10 X PCR BufferCMg2+ free) 2. 5μL,25 mrnol/ L MgClz 2. 0 μL,2. 5 mmol/ L dNTPs 2. 0 μL,上游引物00μmo l/ U O. 5μL,下游引物00μmol/ U O. 5μL,5 U/ μL rTaq DNA 聚合酶O. 5μL,模板DNA 2.0 μL,补ddHz O 至总体积(TotaD 25.0 μL,瞬时离心，置PCR 扩增仪内进行扩增。95 0C 预变性5 min; 循环95 0C 30s , 520C 30s, 720C 120s,30,个循环后72 0C延伸10 min ,5. 4 产物检测,使用0 . 8%琼脂糖凝胶在含有染料CEB 或其替代物)的TAE 缓冲液中进行电泳，在紫……
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